大战绿妖之后，蜘蛛侠帕克（托比•马奎尔 Tobey Maguire 饰）忍痛拒绝了他唯一的挚爱玛丽（克尔斯滕•邓斯特 Kirsten Dunst 饰），因为蜘蛛侠的身份会为自己和亲人带来巨大危险，帕克决定独立承担起蜘蛛侠的责任。                                                                      　　帕克一直在忙于应付各种挑战：学习超能力的灵活运用；在超级英雄与平凡大学生的双重身份下隐藏自我、小心翼翼地生活等等。帕克对玛丽越来越难以自拔，但是作为蜘蛛侠又不能对玛丽展开心扉。                                                                      　　好友哈利因为误会蜘蛛侠而一直处处与其为作对；唯一的亲人婶婶也对蜘蛛侠的真实身份产生了怀疑。同时，新的挑战又出现了：邪恶而强大的章鱼博士。帕克在种种压力下肩负起蜘蛛侠的使命。

正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。                                                                      　　他们合力与恶势力展开斗争……